Cientistas do Instituto McGovern para pesquisa cerebral no MIT e no Broad Institute of MIT e Harvard reengerencialaram uma enzima compacta guiada por RNA que encontraram em bactérias em um editor eficiente e programável do DNA humano.
A proteína que eles criaram, chamada Novaiscb, pode ser adaptada para fazer alterações precisas no código genético, modular a atividade de genes específicos ou realizar outras tarefas de edição. Como seu tamanho pequeno simplifica a entrega às células, os desenvolvedores de Novaiscb dizem que é um candidato promissor para o desenvolvimento de terapias genéticas para tratar ou prevenir doenças.
O estudo foi liderado por Feng ZhangJames e Patricia Poitras Professor de Neurociência do MIT, que também é investigador do McGovern Institute e do Howard Hughes Medical Institute, e um membro central do Broad Institute. Zhang e sua equipe relataram seu trabalho de acesso aberto este mês no diário Biotecnologia da natureza.
O Novaiscb é derivado de um cortador de DNA bacteriano que pertence a uma família de proteínas chamada ISCBS, que o laboratório de Zhang descobriu em 2021. O ISCBS é um tipo de sistema de ômega, os ancestrais evolutivos para Cas9, que faz parte do sistema de CRISPR bacteriano que Zhang e outros se desenvolveram em ferramentas poderosas-editivas genomas. Como o CAS9, as enzimas ISCB cortam o DNA nos locais especificados por um guia de RNA. Ao reprogramar esse guia, os pesquisadores podem redirecionar as enzimas para atingir sequências de sua escolha.
O ISCBS chamou a atenção da equipe não apenas porque eles compartilham os principais recursos do Cas9 de corte de DNA da CRISPR, mas também porque são um terço do seu tamanho. Isso seria uma vantagem para as terapias genéticas em potencial: as ferramentas compactas são mais fáceis de entregar às células e, com uma pequena enzima, os pesquisadores teriam mais flexibilidade para mexer, potencialmente adicionando novas funcionalidades sem criar ferramentas muito volumosas para uso clínico.
A partir de seus estudos iniciais do ISCBS, os pesquisadores do laboratório de Zhang sabiam que alguns membros da família poderiam cortar alvos de DNA nas células humanas. No entanto, nenhuma das proteínas bacterianas funcionou bem o suficiente para ser implantada terapeuticamente: a equipe teria que modificar um ISCB para garantir que ele pudesse editar alvos nas células humanas com eficiência, sem perturbar o restante do genoma.
Para iniciar esse processo de engenharia, Soumya Kannan, uma estudante de graduação no laboratório de Zhang, que agora é membro júnior da Harvard Society of Fellows, e o PostDoc Shiyou Zhu procurou pela primeira vez um ISCB que faria um bom ponto de partida. Eles testaram quase 400 enzimas ISCB diferentes que podem ser encontradas em bactérias. Dez eram capazes de editar o DNA em células humanas.
Mesmo o mais ativo deles precisaria ser aprimorado para torná -lo uma ferramenta útil de edição de genoma. O desafio seria aumentar a atividade da enzima, mas apenas nas sequências especificadas por seu guia de RNA. Se a enzima se tornasse mais ativa, mas indiscriminadamente, ele cortaria o DNA em lugares não intencionais. “A chave é equilibrar a melhoria da atividade e da especificidade ao mesmo tempo”, explica Zhu.
Zhu observa que o ISCBS bacteriano é direcionado para suas seqüências -alvo por guias de RNA relativamente curtos, o que dificulta a restringir a atividade da enzima a uma parte específica do genoma. Se um ISCB pudesse ser projetado para acomodar um guia mais longo, seria menos provável que atue em sequências além do alvo pretendido.
Para otimizar o ISCB para a edição do genoma humano, a equipe alavancou as informações que o estudante de graduação Han Altae-Tran, que agora é pós-doutorado na Universidade de Washington, havia aprendido sobre a diversidade de ISCBs bacterianos e como eles evoluíram. Por exemplo, os pesquisadores observaram que o ISCBS que trabalhava em células humanas incluía um segmento que chamavam de rec, que estava ausente em outros ISCBs. Eles suspeitavam que a enzima poderia precisar desse segmento para interagir com o DNA nas células humanas. Quando examinaram mais de perto a região, a modelagem estrutural sugeriu que, ao expandir uma parte ligeiramente em expansão da proteína, o REC também pode permitir que o ISCBS reconheça guias mais longos de RNA.
Com base nessas observações, a equipe experimentou trocar em partes dos domínios REC de diferentes ISCBs e Cas9s, avaliando como cada mudança afetou a função da proteína. Guiados pelo entendimento de como o ISCBS e o Cas9s interagem com o DNA e seus guias de RNA, os pesquisadores fizeram mudanças adicionais, com o objetivo de otimizar a eficiência e a especificidade.
No final, eles geraram uma proteína que chamavam de Nova, que era mais de 100 vezes mais ativa nas células humanas do que o ISCB com o qual haviam começado, e que demonstraram boa especificidade para seus alvos.
Kannan e Zhu construíram e exibiram centenas de novos ISCBs antes de chegarem a Nova – e todas as mudanças que fizeram na proteína original eram estratégicas. Seus esforços foram guiados pelo conhecimento de sua equipe sobre a evolução natural do ISCBS, bem como as previsões de como cada alteração afetaria a estrutura da proteína, feita usando uma ferramenta de inteligência artificial chamada alphafold2. Comparado aos métodos tradicionais de introdução de alterações aleatórias em uma proteína e triagem para seus efeitos, essa abordagem de engenharia racional acelerou bastante a capacidade da equipe de identificar uma proteína com os recursos que estavam procurando.
A equipe demonstrou que o Nova Miscb é um bom andaime para uma variedade de ferramentas de edição de genoma. “Funciona bioquimicamente de maneira muito semelhante ao CAS9, e isso facilita o porto de ferramentas que já foram otimizadas com o andaime Cas9”, diz Kannan. Com diferentes modificações, os pesquisadores usaram o Nova para substituir letras específicas do código de DNA nas células humanas e alterar a atividade dos genes direcionados.
É importante ressaltar que as ferramentas baseadas em Novaiscb são compactas o suficiente para serem facilmente embaladas dentro de um único vírus adeno-associado (AAV)-o vetor mais comumente usado para fornecer terapia genética com segurança aos pacientes. Por serem mais volumosos, as ferramentas desenvolvidas usando Cas9 podem exigir uma estratégia de entrega mais complicada.
Demonstrando o potencial de uso terapêutico de Nova, a equipe de Zhang criou uma ferramenta chamada Omegaoff que adiciona marcadores químicos ao DNA para discar a atividade de genes específicos. Eles programaram Omegaoff para reprimir um gene envolvido na regulamentação do colesterol e depois usaram o AAV para entregar o sistema ao fígado de ratos, levando a reduções duradouras nos níveis de colesterol no sangue dos animais.
A equipe espera que a Nova Miscb possa ser usada para direcionar ferramentas de edição de genoma para a maioria dos genes humanos e esperamos ver como outros laboratórios implantam a nova tecnologia. Eles também esperam que outros adotem sua abordagem guiada por evolução à engenharia racional de proteínas. “A natureza tem tanta diversidade e seus sistemas têm vantagens e desvantagens diferentes”, diz Zhu. “Ao aprender sobre essa diversidade natural, podemos tornar os sistemas que estamos tentando projetar cada vez mais.”
Este estudo foi financiado, em parte, pela K. Lisa Yang e Hock E. Tan Center for Molecular Therapeutics no MIT, doadores de presentes de terapêuticos programáveis do Broad Institute, Pershing Square Foundation, William Ackman, Neri Oxman, a família Phillips e J. e P. Poitras.
